pcr就是利用dna聚合酶对特定基因做体外或试管内in vitro的大量合成,基本上它是利用dna聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。根据dna扩增的目的和检测的标准,可以将pcr仪分为普通pcr仪,梯度pcr仪,原位pcr仪,实时荧光定量pcr仪四类。
pcr的要素基本的pcr须具备1.要被复制的dna模板 template2.界定复制范围两端的引物primers.3.dna聚合酶taq. polymearse4.合成的原料(四种脱氧核苷酸)及水。
pcr仪也叫基因扩增仪,它是利用pcr技术对特定基因做体外的大量合成,用于以检测dna/rna为目的的各种基因分析。
pcr技术原理
该技术是在模板dna、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下,依赖于dna聚合酶的酶促合成反应。dna聚合酶以单链dna为模板,借助一小段双链dna来启动合成,通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链dna模板中的一段互补序列结合,形成部分双链。在适宜的温度和环境下,dna聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-oh末端,并以此为起始点,沿模板5′→3′方向延伸,合成一条新的dna互补链。
pcr反应步骤
分别是1.变性,2.引物退火,3.引物延伸。 所谓变性是将dna加热至90-95℃变性,将双链dna加热后转为单链dna做为复制的模板. 而引物退火则是引物于一定的温度下(冷却至55-60℃)附着于模板dna两端。 最后在dna聚合酶的作用下(加热至70-75℃)进行引物的延伸及另一链的合成。
根据dna扩增的目的和检测的标准,可以将pcr仪分为普通pcr仪,梯度pcr仪,原位pcr仪,实时荧光定量pcr仪四类。
基因扩增pcr仪的使用方法:
pcr由变性--退火(复性)--延伸三个基本反应步骤构成:①模板dna的变性:模板dna经加热至90~95℃一定时间后,使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板dna与引物的退火(复性):模板dna经加热变性成单链后,温度降至55~60℃,引物与模板dna单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:dna模板--引物结合物在dna聚合酶的作用下,于70~75℃,以dntp为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
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